机器学习技术发展历程

一、机器学习技术发展历程

机器学习技术发展历程

机器学习技术是人工智能领域中的重要分支，随着科技的发展，机器学习技术在过去几十年取得了巨大的进步和突破。从最初的概念提出到如今在各行各业都得到广泛应用，机器学习技术的发展历程可以说是跌宕起伏，充满着挑战与机遇。

起源阶段

机器学习技术最早可以追溯到上世纪50年代，当时科学家们开始探讨如何让计算机具有类似人类学习能力的功能。这一阶段的研究主要集中在机器如何通过模拟人类认知过程来实现学习。虽然技术还十分原始，但这些探索为后来的发展奠定了基础。

发展阶段

20世纪80年代至90年代，随着计算机性能的提升和数据存储技术的进步，机器学习技术进入了快速发展的阶段。专家系统、神经网络等新技术被引入，为机器学习的研究带来了新的思路和方法。人工智能领域也逐渐进入了大众视野，对机器学习技术的应用需求不断增加。

高速发展阶段

进入21世纪，机器学习技术迎来了高速发展的时期。大数据、云计算、深度学习等新兴技术的出现为机器学习的应用提供了更多可能性。在图像识别、语音识别、自然语言处理等领域取得了许多突破性进展，逐渐实现了人机交互的深度融合。

应用普及阶段

如今，机器学习技术已经走进了人们的生活的方方面面。从智能手机的语音助手到自动驾驶汽车，从医疗诊断到金融风控，机器学习技术的应用无处不在。无论是科研领域还是商业领域，机器学习技术都展现出巨大的潜力和价值。

未来展望

随着技术的不断进步和创新，机器学习技术的未来充满着无限可能。从强化学习到元学习，从自监督学习到联邦学习，机器学习技术将不断迭代升级，为人类创造更加智能和便利的生活环境。

总的来说，机器学习技术的发展历程是一个承前启后、不断创新的过程。在不断挑战和探索中，机器学习技术走过了漫长的道路，但每一步都是宝贵的经验。相信在未来的日子里，机器学习技术将继续引领人类走向智能化、数字化的未来。

二、通信技术发展历程？

通信技术最早可以追溯到古埃及的烽火台和中国的驿站，它们都是最早的远程通信方式。

现代通信技术始于19世纪，当时电报和电话被发明出来，使得人们可以远距离传递信息。

20世纪，随着电视、电脑和互联网的出现，通信技术得到了飞速的发展。21世纪初，移动通信技术又将人类带入了一个全新的通信时代。如今，随着卫星通信、物联网、5G等技术的不断发展，通信技术的应用范围越来越广泛，对人类社会的影响也越来越深远。

三、dna重组技术发展历程？

年份 事 件

1869 F Miescher首次从莱茵河鲑鱼精子中分离DNA。

1944 O.T. Avery证实DNA是遗传物质。

1952 A.D. Hershey和M.Chase再次证实和噬菌体的遗传物质是DNA。

1953 J.D.Watson和F.H.C.Crick提出DNA分子结构的双螺旋模型。

M.Wilkins用X-射线衍射法证实了这一结构。

1957 A.Kornberg从大肠杆菌中发现了DNA聚合酶I。

1958 M. Meselson和F. W. Stahl提出了DNA的半保留复制模型。

1959-1960 S. Ochoa发现RNA聚合酶和信使RNA，并证明mRNA决定了

蛋白质分子中的氨基酸序列。

1961 Nirenberg破译了第一相遗传密码；F. Jacob和J. Monod提出了调

节基因表达的操纵子模型。

1964 C. Yanofsky和S. Brenner等人证明，多肽链上的氨基酸序列与该基

因中的核苷酸序列存在着共线性关系。

1965 S. W. Holley完成了酵母丙氨酸tRNA的全序列测定；科学家证明细

菌的抗药性通常由'质粒'DNA所决定。

1966 M.W.Nirenberg，S.Ochoa、H.G.Khorana、F.H.C.Crick等人破译

了全部遗传密码。

1970 H.O.Smith，K.W.Wilcox和T.J.Kelley分离了第一种限制性核酸内

切酶。H.M.Temin和D.Baltimore从RNA肿瘤病毒中发现反转录酶。

1972-1973 H.Boyer，P.Berg等人发展了DNA重组技术，于72年获得第一

个重组DNA分子，73年完成第一例细菌基因克隆。

1975-1977 F.Sanger与A.Maxam、W.Gilbert等人发明了DNA序列测定技

术。1977年完成了全长5387bp的噬菌体φ174基因组测定。

1978 首次在大肠杆菌中生产由人工合成基因表达的人脑激素和人胰岛素。

1980 美国联邦最高法院裁定微生物基因工程可以专利化。

1981 R. D. Palmiter和R. L. Brinster获得转基因小鼠；A. C. Spradling

和G. M. Rubin得到转基因果蝇。

1982 美、英批准使用第一例基因工程药物--胰岛素；Sanger等人完成了入

噬菌体48,502bp全序列测定。

1983 获得第一例转基因植物。

1984 斯坦福大学获得关于重组DNA的专利。

1986 GMO首次在环境中释放。

1988 J. D. Watson出任'人类基因组计划'首席科学家。

1989 DuPont公司获得转肿瘤基因小氧--'Oncomouse'。

1992 欧共体35个实验室联合完成酵母第三染色体全序列测定

1994 第一批基因工程西红柿在美国上市。

1996 完成了酵母基因组(1.25×107bp)全序列测定。

1997 英国爱丁堡罗斯林研究所获得克隆羊。

J.D.Watson 据说是个表较闲散的人，天天就知道等着喝下午茶，然后就是端装茶杯到处逛，看别人一天到晚做什么。有一天逛到了在别人的实验室看到了双螺旋结构而茅塞顿开，从而打开了人类生命奥秘之门。

四、农业技术发展历程？

人类早期使用的生产工具从用火开始再会制作棍棒，同时还学会了把石斧、石锄等经过磨制的石器缚在木棍上（耒耜）,用来开荒掘地,种植作物。

后来有些地方发明了简单的木犁和青铜农具，并用驯化了的牛、马等大牲畜作为役畜来牵引。

但主要的工具仍是取自自然界的木、石等材料，主要的动力也还是人的劳动。

它的突出成就就是对野生动植物的驯化，今天常见的主要作物和家畜大多在4000年以前已基本完成驯化过程。但由于生产技术水平低和不稳定，仍经常以采集、狩猎作为辅助手段。

五、厌氧发酵技术发展历程？

厌氧发酵是指废弃物在厌氧条件下通过微生物的代谢活动而被稳定化，同时伴有甲烷和CO2产生的变化，液化阶段主要是发酵细菌起作用，包括纤维素分解菌和蛋白质水解菌。

原理

液化阶段主要是发酵细菌起作用，包括纤维素分解菌和蛋白质水解菌，产酸阶段主要是醋酸菌起作用，产甲烷阶段主要是甲烷细菌，他们将产酸阶段产生的产物降解成甲烷和CO2同时利用产酸阶段产生的氢将CO2还原成甲烷

厌氧发酵

厌氧发酵是指废弃物在厌氧条件下通过微生物的代谢活动而被稳定化，同时伴有甲烷和CO2产生的变化，液化阶段主要是发酵细菌起作用，包括纤维素分解菌和蛋白质水解菌。

影响

厌氧发酵的影响因素有:原料配比，厌氧发酵的碳氮比以20-30为宜，当碳氮比在35时产期量明显下降;温度在35-40℃为宜;pH值对于甲烷细菌来说，维持弱碱环境是绝对必要的，它的最佳pH范围为6.8-7.5，pH值低，它使CO2大增，大量水溶性有机物和H2S产生，硫化物含量的增加抑制了甲烷菌的生长，可以加石灰调节pH，但是调整pH的最好方法是调整原料的碳氮比，因为底质中用以中和酸的碱度主要是氨氮，底质含氮量越高，碱度越大，当VFA(挥发性脂肪酸)>3000时，反应会停止。

作用

利用厌氧微生物的转化作用，将垃圾中大部分可生物降解的有机物质进行分解，转化为沼气的处理方式。

优点

厌氧发酵是一种成熟的垃圾能源化技术，将垃圾转化成沼气后，便于输送和储存，热值高，燃烧污染小，用途广泛。

六、分子鉴定技术发展历程？

分子诊断技术是指以DNA和RNA为诊断材料，用分子生物学技术通过检测基因的存在、缺陷或表达异常，从而对人体状态和疾病作出诊断的技术。其基本原理是检测DNA或RNA的结构是否变化、量的多少及表达功能是否异常，以确定受检者有无基因水平的异常变化，对疾病的预防、预测、诊断、治疗和预后具有重要意义。通俗简单的讲所有基于分子生物学水平的方法学技术都属于分子诊断技术，比如PCR技术、基因测序技术等等。

PCR技术即聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，基本原理类似于DNA的天然复制过程，由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA的变性，模板DNA与引物的退火(复性)，引物的延伸。重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。由1983年美国Mullis首先提出设想，1985年由其发明了聚合酶链反应，即简易DNA扩增法，意味着PCR技术的真正诞生。简单讲PCR技术本质上是针对DNA片段进行扩增放大，通过实时荧光PCR技术使得样本中DNA含量可以检测出来。

基因测序技术即测定DNA序列的技术。在分子生物学研究中，DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。目前用于测序的技术主要有Sanger等（1977）发明的双脱氧链末端终止法和 Maxam和 Gilbert（1977）发明的化学降解法。这二种方法在原理上差异很大，但都是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，产生 A，T，C，G四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得DNA序列。目前 Sanger测序法得到了广泛的应用。简单讲基因测序技术是针对DNA片段进行测序和分析，使得DNA序列得以清晰。

下面一起来了解一下分子诊断技术近50年的发展历程：

一、基于分子杂交的分子诊断技术

上世纪60年代至80年代是分子杂交技术发展最为迅猛的20年,由于当时尚无法对样本中靶基因进行人为扩增,人们只能通过已知基因序列的探针对靶序列进行捕获检测。其中液相和固相杂交基础理论、探针固定包被技术与cDNA探针人工合成的出现,为基于分子杂交的体外诊断方法进行了最初的技术储备。

(一)DNA印迹技术(Southern blot)

Southern[1]于1975年发明了DNA印迹技术,通过限制性内切酶将DNA片段化,再以凝胶电泳将长度不等的DNA片段进行分离,通过虹吸或电压转印至醋酸纤维膜上,再使膜上的DNA变性与核素标记的寡核苷酸探针进行分子杂交,经洗脱后以放射自显影鉴别待测的DNA片段-探针间的同源序列。这一方法由于同时具备DNA片段酶切与分子探针杂交,保证了检测的特异性。因此,一经推出后便成为探针杂交领域最为经典的分子检测方法,广为运用于各种基因突变,如缺失、插入、易位等,及与限制性酶切片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)的鉴定中。Alwine等[2]于1977年推出基于转印杂交的Northern blot技术也同样成为当时检测RNA的金标准。

(二)ASO反向斑点杂交(allele-specific oligonucleotide reverse dot blot,ASO-RDB)

使用核酸印迹技术进行核酸序列的杂交检测具有极高的特异性,但存在操作极为繁琐,检测时间长的缺点。1980年建立的样本斑点点样固定技术则摆脱了传统DNA印迹需要通过凝胶分离技术进行样本固定的缺点。通过在质粒载体导入单碱基突变的方法,构建了首条等位基因特异性寡核苷酸探针(allele-specific oligonucleotide,ASO),更使对核酸序列点突变的检测成为可能。1986年,Saiki[3]首次将PCR的高灵敏度与ASO斑点杂交的高特异性结合起来,实现了利用ASO探针对特定基因多态性进行分型。其后为了完成对同一样本的多个分子标记进行高通量检测,Saiki[4]又发明了ASO-RDB,通过将生物素标记的特异性PCR扩增产物与固定于膜上的探针杂交显色,进行基因分型、基因突变的检测。该法可将多种寡核苷酸探针固定于同一膜条上,只需通过1次杂交反应,即可筛查待检样本DNA的数十乃至数百种等位基因,具有操作简单、快速的特点,一度成为基因突变检测、基因分型与病原体筛选最为常用的技术。

(三)荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)

FISH源于以核素标记的原位杂交技术,1977年Rudkin[5]首次使用荧光素标记探针完成了原位杂交的尝试。在上世纪8090年代,细胞遗传学和非同位素标记技术的发展将FISH推向临床诊断的实践应用。相比于其它仅针对核酸序列进行检测的分子诊断技术,FISH结合了探针的高度特异性与组织学定位的优势,可检测定位完整细胞或经分离的染色体中特定的正常或异常DNA序列;由于使用高能量荧光素标记的DNA探针,可实现多种荧光素标记同时检测数个靶点。

如今,FISH已在染色体核型分析,基因扩增、 基因重排、病原微生物鉴定等多方面中得到广泛应用。通过比较基因组杂交(comparative genomic hybridization,CGH)与光谱核型分析(spectral karyotyping,SKY)等FISH衍生技术,使其正在越来越多的临床诊断领域中发挥作用。

(四)多重连接探针扩增技术(multiplex ligation dependent probe amplification,MLPA)

MLPA技术于2002年由Schouten等[6]首先报道。每个MLPA探针包括2个荧光标记的寡核苷酸片段,1个由化学合成,1个由M13噬菌体衍生法制备;每个探针都包括1段引物序列和1段特异性序列。在MLPA反应中,2个寡核苷酸片段都与靶序列进行杂交,再使用连接酶连接2部分探针。连接反应高度特异,只有当2个探针与靶序列完全杂交,连接酶才能将2段探针连接成1条完整的核酸单链;反之,如果靶序列与探针序列不完全互补,即使只有1个碱基的差别,就会导至杂交不完全,使连接反应无法进行。连接反应完成后,用1对荧光标记的通用引物扩增连接好的探针,每个探针扩增产物的长度都是唯一的。最后,通过毛细管电泳分离扩增产物,便可对把核酸序列进行检测。由于巧妙地借鉴了扩增探针的原理,MLPA技术最多可在1次反应中对45个靶序列的拷贝数进行鉴定。

该技术具备探针连接反应的特异性与多重扩增探针杂交的高通量特性。经过MRC-Holland公司10余年的发展,MLPA技术已成为涵盖各种遗传性疾病诊断、药物基因学多遗传位点鉴定、肿瘤相关基因突变谱筛查、DNA甲基化程度定量等综合分子诊断体系,是目前临床最为常用的高通量对已知序列变异、基因拷贝数变异进行检测的方法。

(五)生物芯片

1991年Affymetrix公司的Fordor[7]利用其所研发的光蚀刻技术制备了首个以玻片为载体的微阵列,标志着生物芯片正式成为可实际应用的分子生物学技术。时至今日,芯片技术已经得到了长足的发展,如果按结构对其进行分类,基本可分为基于微阵列(microarray)的杂交芯片与基于微流控(microfluidic)的反应芯片2种。

1.微阵列芯片

(1)固相芯片:微阵列基因组DNA分析(microarray-based genomic DNA profiling,MGDP)芯片:将微阵列技术应用于MGDP检测中已有超过十年的历史,其技术平台主要分为2类,即微阵列比较基因组杂交(array-based comparative genome hybridization,aCGH)和基因型杂交阵列(SNP array)。顾名思义,aCGH芯片使用待测DNA与参比DNA的双色比对来显示两者间的拷贝数变异(CNV)的变化,而单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)芯片则无需与参比DNA进行比较,直接通过杂交信号强度显示待测DNA中的SNP信息。随着技术的不断进步,目前市场上已出现可同时检测SNP与CNV的高分辨率混合基因阵列芯片。MGDP芯片主要应用于发育迟缓、先天性异常畸形等儿童遗传病的辅助诊断及产前筛查。经验证,使用MGDP芯片进行染色体不平衡检测与FISH的诊断符合率可达100%[8],表达谱芯片(gene expression profiling array,GEP array):1999年,Duggan等[9]首次使用cDNA芯片绘制了mRNA表达谱信息。随着表观遗传学在疾病发生发展中的作用日益得到重视,目前也已出现microRNA芯片、长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)芯片等。类似于MGDP芯片,GEP芯片使用反转录后生成的cDNA文库与固定于芯片载体上的核酸探针进行杂交,从而检测杂交荧光信号的强度判断基因的表达情况。相较于基因组杂交,GEP芯片对生物学意义更为重要的转录组信息进行检测,对疾病的诊断与预后判断具有特殊的意义。目前使用GEP芯片对急性髓细胞白血病、骨髓增生异常综合征等血液病及神经退行性变等进行诊断、分类及预后评估已经获得了令人满意的效果;

(2)液相芯片:传统固相芯片将检测探针锚定于固相载体上捕获目的序列,而Luminex公司的xMAP技术[10]则通过搭配不同比例的2种红色荧光染料,将聚苯乙烯微球标记为不同的荧光色,并对其进行编码得到具有上百种荧光编号的微球。通过xTAG技术将不同的特异性杂交探针交联至编码微球上,使得不同的探针能够通过微球编码得以区分。利用混合后的探针-微球复合物与待测样本进行杂交,使微球在流动鞘液的带动下通过红绿双色流式细胞仪,其中红色激光检测微球编码,绿色荧光检测经杂交后核酸探针上荧光报告基团的信号强度,一次完成对单个样本中多种靶序列的同时鉴定。目前,该技术已在囊性纤维化等遗传性疾病诊断、多种呼吸道病毒鉴定及人乳头瘤病毒分型取得了广泛的应用。

2.微流控芯片

1992年Harrison等[11]首次提出了将毛细管电泳与进样设备整合到固相玻璃载体上构建“微全分析系统”的构想,通过分析设备的微型化与集成化,完成传统分析实验室向芯片上实验室(lab-on-chip)的转变。微流控芯片(microfluidic chip)由微米级流体的管道、反应器等元件构成,与宏观尺寸的分析装置相比,其结构极大地增加了流体环境的面积/体积比,以最大限度利用液体与物体表面有关的包括层流效应、毛细效应、快速热传导和扩散效应在内的特殊性能,从而在1张芯片上完成样品进样、预处理、分子生物学反应、检测等系列实验过程。

目前使用微流控芯片进行指导用药的多基因位点平行检测是主要临床应用领域。

二、核酸序列测定

测序反应是直接获得核酸序列信息的唯一技术手段,是分子诊断技术的一项重要分支。虽然分子杂交、分子构象变异或定量PCR技术在近几年已得到了长足的发展,但其对于核酸的鉴定都仅仅停留在间接推断的假设上,因此对基于特定基因序列检测的分子诊断,核酸测序仍是技术上的金标准。

(一)第1代测序

1975年Sanger与Coulson发表了使用加减法进行DNA序列测定的方法,随后Maxam在1977年提出了化学修饰降解法的模型,为核酸测序时代的来临拉开了序幕。

Sanger等于同年提出的末端终止法(Sanger测序法)利用2'与3'不含羟基的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)进行测序引物延伸反应,ddNTP在DNA合成反应中不能形成磷酸二酯键,DNA合成反应便会终止。如果分别在4个独立的DNA合成反应体系中加入经核素标记的特定ddNTP,则可在合成反应后对产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)及放射自显影,根据电泳条带确定待测分子的核苷酸序列。Appied Biosystems公司在Sanger法的基础上,于1986年推出了首台商业化DNA测序仪PRISM 370A,并以荧光信号接收和计算机信号分析代替了核素标记和放射自显影检测体系。该公司于1995年推出的首台毛细管电泳测序仪PRISM 310更是使测序的通量大大提高。Sanger测序是最为经典的一代测序技术,仍是目前获取核酸序列最为常用的方法。

(二)第2代测序

1.焦磷酸测序(Pyro-sequencing)

不同于Sanger测序法所使用的合成后测序理念,Ronaghi分别于1996年与1998年提出了在固相[13]与液相[14]载体中通过边合成边测序的方法-焦磷酸测序。其基本原理是利用引物链延伸时所释放的焦磷酸基团激发荧光,通过峰值高低判断与其相匹配的碱基数量。由于使用了实时荧光监测的概念,焦磷酸测序实现了对特定位点碱基负荷比例的定量,因此在SNP位点检测、等位基因(突变)频率测定、细菌和病毒分型检测方面应用广泛。由于荧光报告原理不同,其对于序列变异的检测灵敏度从Sanger测序的20%提高到了5%。但由于该技术的仪器采购与单次检测成本较高,目前尚未得到大规模的临床使用。

2.高通量第2代测序

目前常见的高通量第二代测序平台主要有Roche 454、Illumina Solexa、ABI SOLiD和Life Ion Torrent等,其均为通过DNA片段化构建DNA文库、文库与载体交联进行扩增、在载体面上进行边合成边测序反应,使得第1代测序中最高基于96孔板的平行通量扩大至载体上百万级的平行反应,完成对海量数据的高通量检测。该技术可以对基因组、转录组等进行真正的组学检测,在指导疾病分子靶向治疗、绘制药物基因组图谱指导个体化用药、感染性疾病的病原微生物宏基因组鉴定及通过母体中胎儿DNA信息进行产前诊断等方面已经取得了喜人的成绩。然而,由于该技术需要对DNA进行片段化处理,测序反应读长较短(如Solexa与SOLiD系统单次读长仅50bp),需要对数据进行大规模拼接,因此对分子诊断工作者掌握生物信息学知识提出了更高要求,以利于后期的测序数据分析。

(三)第3代测序

第3代测序技术的核心理念是以单分子为目标的边合成边测序。该技术的操作平台目前主要有Helicos公司的Heliscope、Pacific Biosciences公司的SMRT和Oxford Nanopore Technologies公司的纳米孔技术等。该技术进一步降低了成本,可对混杂的基因物质进行单分子检测,故对SNP、CNV的鉴定更具功效。但是目前其进入产品商业化,并最终投入临床应用仍有很长的距离。

三、基于分子构象的分子诊断技术

(一)变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)与单链构象多态性(single strand conformation polymorphism,SSCP)

1970~1980年间,Fischer等[15]与Orita等[16]分别提出了利用核酸序列变异所导至双链变性条件差异与单链空间折叠差异,通过变性与非变性PAGE对变异序列进行分离鉴定的方法,即DGGE与SSCP。上述2项技术均通过变异核酸分子在空间构象上的差异,通过特定条件下电泳速率的变化进行检测。正因为核酸分子构象具有序列特异性,且对于序列的改变非常敏感,常常1个碱基的变化也能得到鉴定。但由于DGGE与SSCP均必须进行PCR后开盖电泳的操作,现已不常见于临床检测。

(二)变性高效液相色谱(denaturing high-performance liquid chromatography,dHPLC)

1997年,Oefner和Underhill建立[17,18]了利用异源双链变性分离变异序列、使用色谱洗脱鉴定的技术,称为dHPLC,可自动检测单碱基置换及小片段核苷酸的插入或缺失。对于存在一定比例变异序列的核酸双链混合物,其经过变性和复性过程后,体系内将出现2种双链:一种为同源双链,由野生正义链-野生反义链或变异正义链-变异反义链构成的核酸双链;另一种为异源双链,即双链中1条单链为野生型,而另1条为变异型。由于存在部分碱基错配的异源双链 DNA与同源双链DNA的解链特征不同,在相同的部分变性条件下,异源双链因存在错配区而更易变性,被色谱柱保留的时间短于同源双链,故先被洗脱下来,从而在色谱图中表现为双峰或多峰的洗脱曲线。由于该技术使用了较高分析灵敏度的色谱技术进行检测,可快速检出<5%负荷的变异序列。但需注意的是,由于该技术主要通过异源双链进行序列变异检测,其不能明显区分野生型与变异型的纯合子。

(三)高分辨率熔解分析(high-resolution melting analysis,HRMA)

2003年,Wittwer等[19]首次革命性地使用过饱和荧光染料将PCR产物全长进行荧光被动标记,再通过简单的产物熔解分析对单个碱基变化进行鉴定。该技术的原理也是通过异源双链进行序列变异鉴定。待测样本经PCR扩增后,若存在序列变异杂合子,则形成异源双链,其熔解温度大大下降。此时由于双链被饱和染料完全填充,其产物熔解温度的变化便可通过熔解曲线的差异得以判定。对于变异纯合子而言,HRMA也可利用其较高的分辨率完成PCR产物单个位点A:T双键配对与G:C三建配对热稳定性差异的鉴定,但是对于Ⅱ、Ⅲ类SNP的纯合子变异则无法有效区分。

如何利用DNA构象对序列进行推测,从而避免成本较高的序列测定或操作繁琐的杂交反应一直是分子生物学研究与应用的热点问题。目前,使用构象变化对序列变异进行间接检测的便捷性已得到一致肯定,尤其是HRMA可完成对变异序列单次闭管的扩增检测反应。但需要注意的是,由于基于构象变化的分子检测手段多无法通过探针杂交或核酸序列测定对检测的特异性进行严格的保证,因此其只适合大规模的初筛,而真正的确诊仍需要进行杂交或测序的验证。

四、定量PCR(quantitative PCR,qPCR)

相比于其他分子诊断检测技术,qPCR具有2项优势,即核酸扩增和检测在同一个封闭体系中通过荧光信号进行,杜绝了PCR后开盖处理所带来扩增产物的污染;同时通过动态监测荧光信号,可对低拷贝模板进行定量。正是由于上述技术优势,qPCR已经成为目前临床基因扩增实验室接受程度最高的技术,在各类病毒、细菌等病原微生物的鉴定和基因定量检测、基因多态性分型、基因突变筛查、基因表达水平监控等多种临床实践中得到大量应用。但伴随着qPCR技术的迅猛发展,有关这项技术的质量管理问题也日益突出,如何消除各类生物学变量所引起的检测变异,减少或抑制实验操作与方法学中的各种干扰因素是qPCR技术面临的难题。

(一)实时荧光定量PCR(real-time PCR)

1.双链掺入法

1992年Higuchi等[20-21]通过在PCR反应液中掺入溴乙锭对每个核酸扩增热循环后的荧光强度进行测定,提出了使用荧光强度与热循环数所绘制的核酸扩增曲线,定量反应体系中初始模板的反应动力学(real-time PCR)模型,开创了通过实时闭管检测荧光信号进行核酸定量的方法。核酸染料可以嵌入DNA双链,且只有嵌入双链时才释放荧光,在每1次的扩增循环后检测反应管的荧光强度,绘制荧光强度-热循环数的S形核酸扩增曲线,以荧光阈值与扩增曲线的交点在扩增循环数轴上的投影作为循环阈值(Cycle threshold,Ct),则Ct与反应体系中所含初始模板数量呈负指数关系,推断初始模板量。随后Morrison[22]提出了使用高灵敏度的双链染料SYBR Green I进行反应体系中低拷贝模板定量的方法。这一方法操作简便,但由于仅使用扩增引物的序列启动核酸扩增,其产物特异性无法得到充分保证。虽然在实时荧光定量PCR反应后可通过熔解曲线对产物特异性进行检验,但其特异性明显逊于使用荧光探针进行检测,因此双链掺入法并未在临床实践中得到认可。

2.Taqman探针

由于双链掺入法存在特异性较低的问题,1996年Heid[23]综合之前发现的Taq酶的5'核酸酶活性与荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)探针的概念提出了使用Taqman探针进行qPCR的方法。TaqMan探针的本质是FRET寡核苷酸探针,在探针的5'端标记荧光报告基团,3'端标记荧光淬灭基团,利用Taq酶具有5'3'外切酶活性,在PCR过程中水解与靶序列结合的寡核苷酸探针,使荧光基团得以游离,释放荧光信号。从而使能够与靶序列杂交的探针在扩增过程中释放荧光,通过real-time PCR的原理对其进行定量。由于其超高的特异性与成功的商品化推广,Taqman探针已经成为目前临床使用最为广泛的qPCR方法,其在各种病毒基因定量检测、基因分型、肿瘤相关基因表达检测等方面具有着不可替代的地位。

3.分子信标

同样在1996年,Tyagi等[24] 提出了使用分子信标(moleuclar beacons)进行qPCR的方法,分子信标是5'与3'端分别标记有荧光报告基团与淬灭基团的寡核苷酸探针,其两端具有互补的高GC序列,在qPCR反应液中呈发夹结构,荧光基团与淬灭基团发生荧光共振能量转移(FRET)而保持静息状态。当PCR反应开始后,茎环结构在变性高温条件下打开,释放荧光;在退火过程中,靶序列特异性探针则与模板杂交保持线性,不能与模板杂交的探针则复性为茎环结构而荧光淬灭,通过检测qPCR体系中退火时的荧光信号强度,便可以real-time PCR原理特异性检测体系中的初始模板浓度。相比于Taqman探针,分子信标使用发卡结构使荧光基团与淬灭基团在空间上紧密结合,大大降低了检测的荧光背景,其检测特异性较Taqman探针更高,更适合等位基因的分型检测。

4.双杂交探针

1997年,Wittwer等[25]发表了使用分别标记荧光供体基团与荧光受体基团的2条相邻寡核苷酸探针进行qPCR的方法。双杂交探针所标记的供体基团和受体基团的激发光谱间具有一定重叠,且2条探针与靶核酸的杂交位置应相互邻近。仅当2条探针与靶基因同时杂交时,供体与受体基因得以接近,从而通过FRET发生能量传递,激发荧光信号,荧光信号强度与反应体系中靶序列DNA含量呈正比。由于使用了2条探针进行靶序列杂交,该方法的特异性比传统单探针检测体系得到了极大地提升。

(二)数字PCR

早在上世纪90年代就出现了使用微流控阵列对单次qPCR反应进行分散检测的概念。基于这一理念,Vgelstein与Kinzter[26]于1999年发表了数字PCR(digital PCR)的方法,对结肠癌患者粪便中的微量 K-RAS基因突变进行了定量。相比于传统的qPCR方法,数字PCR的核心是将qPCR反应进行微球乳糜液化,再将乳糜液分散至芯片的微反应孔中,保证每个反应孔中仅存在≤1个核酸模板。经过PCR后,对每个微反应孔的荧光信号进行检测,存在靶核酸模板的反应孔会释放荧光信号,没有靶模板的反应孔就没有荧光信号,以此推算出原始溶液中待测核酸的浓度。因此,数字PCR是1种检测反应终点荧光信号进行绝对定量的qPCR反应,而非以模板Ct值进行核酸定量的real-time PCR。

经由Quantalife公司开发(已于2011年被BIO-RAD收购)的微滴式数字PCR是首款商品化的数字PCR检测系统,目前已被广泛运用于微量病原微生物基因检测、低负荷遗传序列鉴定、基因拷贝数变异与单细胞基因表达检测等多个临床前沿领域。与传统qPCR相比较,该技术具有超高的灵敏度与精密度,使其成为目前qPCR领域的新星。

五、对未来5年的展望

半个世纪以来分子诊断的高速发展离不开分子生物学技术日新月异的进步。概而言之,在过去的50年中分子诊断技术取得了三大转化与3项提升:即报告信号检测从放射核素标记向荧光标记转化,操作方法由手工操作向全自动化转化,检测分析通量从单一标志物向高通量多组学联合判断转化;检测灵敏度、精密度、特异性的快速提升。

在未来5年中,我国分子诊断事业将迎来两方面的进步。随着卫生监管部门对分子诊断重要性的认识不断深入与越来越多高学历、高素质人才的进入,分子诊断将会出现理念的革命性进步,高通量技术将更多的进入临床的实际应用中。随着技术的进一步发展,传统针对特定基因异常、病原微生物感染鉴定的方法学,也将在检测的各项分析性能与操作便捷程度上取得长足的进步。对于传统人力与时间成本较高的检测方法学,将出现两极分化的态势,即Southern等经典的检测金标准将得到保留;而ASO-RDB等灵敏度、特异性均不能满足实际临床需求的方法将快速被新型技术所取代。最终,分子诊断也必将一改目前仅仅用于病原微生物基因检测与部分遗传性疾病诊断的局面,形成由肿瘤学、遗传学、微生物学、药物基因组学四足鼎立,快速发展的景象。

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七、电子封装技术发展历程？

第一阶段（20世纪70年代之前）

以通孔插装型封装为主；典型的封装形式包括最初的金属圆形(TO型)封装，以及后来的陶瓷双列直插封装(CDIP)、陶瓷-玻璃双列直插封装(Cer DIP)和塑料双列直插封装(PDIP)等；其中的PDIP,由于其性能优良、成本低廉，同时又适于大批量生产而成为这一阶段的主流产品。

第二阶段（20世纪80年代以后）

从通孔插装型封装向表面贴装型封装的转变，从平面两边引线型封装向平面四边引线型封装发展。表面贴装技术被称为电子封装领域的一场革命，得到迅猛发展。与之相适应，一些适应表面贴装技术的封装形式，如塑料有引线片式裁体（PLCC）、塑料四边引线扁平封装（PQFP）、塑料小外形封装（PSOP）以及无引线四边扁平封装（PQFN）等封装形式应运而生，迅速发展。其中的PQFP，由于密度高、引线节距小、成本低并适于表面安装，成为这一时期的主导产品。

第三阶段（20世纪90年代以后）

半导体发展进入超大规模半导体时代，特征尺寸达到0.18-0.25µm，要求半导体封装向更高密度和更高速度方向发展。因此，半导体封装的引线方式从平面四边引线型向平面球栅阵列型封装发展，引线技术从金属引线向微型焊球方向发展。

在此背景下，焊球阵列封装（BGA）获得迅猛发展，并成为主流产品。BGA按封装基板不同可分为塑料焊球阵列封装（PBGA），陶瓷焊球阵列封装（CBGA），载带焊球阵列封装（TBGA），带散热器焊球阵列封装(EBGA)，以及倒装芯片焊球阵列封装（FC-BGA）等。

为适应手机、笔记本电脑等便携式电子产品小、轻、薄、低成本等需求，在BGA的基础上又发展了芯片级封装（CSP）;CSP又包括引线框架型CSP、柔性插入板CSP、刚性插入板CSP、园片级CSP等各种形式，目前处于快速发展阶段。

同时，多芯片组件（MCM）和系统封装（SiP）也在蓬勃发展，这可能孕育着电子封装的下一场革命性变革。MCM按照基板材料的不同分为多层陶瓷基板MCM（MCM-C）、多层薄膜基板MCM（MCM-D）、多层印制板MCM（MCM-L）和厚薄膜混合基板MCM（MCM-C/D）等多种形式。SiP是为整机系统小型化的需要，提高半导体功能和密度而发展起来的。

SiP使用成熟的组装和互连技术，把各种集成电路如CMOS电路、GaAs电路、SiGe电路或者光电子器件、MEMS器件以及各类无源元件如电阻、电容、电感等集成到一个封装体内，实现整机系统的功能。

目前，半导体封装处于第三阶段的成熟期与快速增长期，以BGA/CSP等主要封装形式开始进入规模化生产阶段。同时，以SiP和MCM为主要发展方向的第四次技术变革处于孕育阶段。

八、创新技术发展历程描述？

第一代创新技术，是突出思维的不同，创新效率很低 第二代创新技术，将系统建模，将创新规模化效率很高 第三代创新技术，从人思维的角度入手，有助于解决开放环境下的创新以及创新途径问题

九、铁道工程技术发展历程？

高铁的发展带来了生活的便利，如今中国人的出行，高铁已然成为首选。中国高铁能够发展到如今的盛况，背后经历了近百年的曲折道路。中国高铁在百年前是落后于西方国家的，中国发挥励精图治的精神。至今中国高铁已经长达1.9万公里，覆盖全国各大城市，一跃坐上了世界第一的宝座。

铁路发展的萌芽

铁路是连接世界的工具，促进了现代化的交流。铁路最早兴起在工业革命时代。1830年，以利物浦－曼彻斯特命名的铁路正式通航，标志着铁路时代来临。铁路的出现，缩短了人与人之间的距离，加强了各地人类的交流，远航成为了触手可及的事情。

1876年，是中国铁路发展最有意义的一年，上海英商怡和洋行修建了中国的第一条铁路，迈出了中国铁路发展的第一步。铁路是中国前所未有的存在，一经问世便伴随着许多争议。

当时中国在晚清政府的统治下，大部分人都认为修建铁路会减少苦力人口就业机会，加之当时的中国刚历经鸦片战争后不久，帝国主义的军事威胁依然存在于世。多方的压力导致中国铁路的发展的步伐暂停。整个80年代，中国铁路事业的发展几乎处于停滞阶段。

中国铁路的进一步发展，追溯到了1911年，当时的中国正值辛亥革命，民主党推翻了清政府的统治，建立了民主共和。新时代的到来，给中国铁路的发展带来了生机，不过五年中国新建铁路已长达9500公里，这是中国铁路的巨大飞跃。

中国铁路尽管已经取得了量的突变，但是对于中国10亿的人口来说的，依然处于待发展的水平。

高铁时代的到来

新中国成立以后，江提出了减小东西部经济差距的想法，实施青藏铁路线成为了计划的关键部分。1999年，中国铁路开始投入到青藏铁路的修建计划中，在铁路修建规划过程中，遇到最大的困难是西藏有着数以百英里计的冻土地，这给铁路修建带来了技术上的难题。

中国人秉持着不惧困难，攻坚难题的精神，将途经格尔木路线确定为最终的方案。经过了长达6年的工期，2006年青藏铁路全线完工，打破了当时世界上的多项纪录。

1993年以前，中国铁路的平均时速仅达到48公里每小时，在高速公路以及航空事业的竞争压力下，中国铁路开始研究如何将时速提高到高速水平。在90年代末终于达成了这一目标，将中国铁路的速度提高至161公里每小时。

在中国高铁雏形形成之初，中国政府对此的期待不仅如此，其最终的目标是将铁路推广成为人民出行最基础的交通设备。为了实现这一愿望，中国开始走上建立时速超过两百公里每小时的铁路网络的道路。

与西门子的谈判

在新中国成立之初，国内的科学技术不足以支撑铁路事业的高速发展，当务之急是必须引入国外先进技术。2004年，中国政府发布了一则重要方针，优先引进国外技术，实施联合发展的策略，着重打造属于中国的品牌。致力于创建一条引入外国技术，再进行创新的科技发展道路。

方案确定之后，中国政府宣布向全世界招标采购。当时参与招标的企业包含了位于世界高铁技术发展高点集团，包括了德国的西门子，法国的阿尔斯通，日本的川崎重工和加拿大的庞巴迪。

中国地大物博，人口众多，对于任何一个企业来说都是一块肥肉，四大企业都希望借此机会一举拿下中国市场。当时中国的政策只有一个买主，就是铁道部。高铁技术的每一个零件都由铁道部门代表中国政府统一向制造商下订单。

当时政府明确地规定了三个约定，一是外国技术引进中国铁路市场必须实行关键技术的全面转让，二是必须使用中国品牌实现本土化生产，三是价格必须合理。当时的德国人根本就没有把其他公司放在眼里，开出了高额的价格，并且规定不允许中方进行议价。

因为当时德国西门子的技术比较先进，中方采取议和的态度，希望西门子能够将价格降低。经过两天的谈判，至定标前夜，西门子仍然不愿意将价格降低。

西门子面对中方强硬的态度依然不肯降低价格，令西门子意外的是第二天的招标会上中国选择了法国作为合作伙伴。回到德国之后，错失了与中国合作的西门子谈判团体，被集体炒了鱿鱼，最终导致西门子在中国市场大幅下跌了百分之二十。

如今的中国已经今非昔比，将那些曾经向中国输出技术的国家，狠狠地甩在了身后。中国的发展靠的是不畏艰苦，励精图治的精神，堪称时代标杆。

十、信息与通信技术发展历程？

信息与通信技术的发展历史

(1)最早通信:烽火台、狼烟;信件:电子通信(电报、电话、网络信号)

(2)通信中最重要的两个方面，信息表示、解析方法+信息的传输方法

(3)通信双方事先需要约定好信息的表示方法和解析方法，做到一致，否则信息不能有效传递(4)、I信号的传输方法是指经过编码后的通信信息如何在传输介质上传输的过程。

总结:通信过程其实分为3个步骤:首先发送方先按照信息编码方式对有效信息进行编码(编程成可以在通信线路上传输的信号形态)，然后编码后的信息在传输介质上进行传输，输送给接收方;最后接收方接收到编码信息后进行解码，解码后得到可以理解的有效信息。